ІНСТРУКЦІЯ
для медичного застосування
Тест для визначення активності АСПАРАГІНАЗИ МЕДАК (МААТ)
Кількісний ферментативний тестдля визначення активності аспарагінази.
Каталог № 550.
Тільки для діагностики іп vitro.
Ензим L-Аспарагіназа належитьдо базових препаратів для лікування гострого лімфобластного лейкозу у дітей тадорослих.
Принцип дії аспарагінази у ферментативномурозщепленні амінокислоти аспарагіну до аспарагінової кислоти та аміаку, щопризводить до зниження аспарагіну у плазмі і лікворі (принцип роботи тесту див.нижче).
За допомогою цього тестуможливе вимірювання активності аспарагінази у процесі лікування, що дозволяєоптимізувати терапевтичне використання аспарагінази. Моніторинг активностіаспарагінази проводиться з метою:
• Контролю значення активностіаспарагінази у сироватці крові в процесі терапії як сурогатного параметра, якийхарактеризує руйнування аспарагіну.
• Визначення спричиненоїімунною відповіддю "прихованої" інактивації, яка призводить урезультаті до скорочення тривалості ефективної дії аспарагінази.
• Обгрунтування раціональногорішення про необхідність заміни на альтернативний препарат аспарагінази абозміни режиму дозування.
МААТ тест medac - гомогеннийтест для вимірювання активності аспарагінази. Робить можливим досягання всіхцілей, пов''язаних з моніторіюванням активності аспарагінази.
Принцип тесту
аспарагіназа
Субстрат — -» продукт розпаду А + продукт розпадуВ
ферментативнийгідроліз
Продукт розпаду В + хромоген — > зелене забарвлення
-> змінаабсорбції при довжині хвилі 700 нм.
Аспарагіназа розщеплюєсубстрат, аналогічний аспарагіну, на два продукти розщеплення - А і В.
Вивільнений продукт розпаду Вутворює у результаті комплексної реакції з хромогеном забарвлений у зеленийколір продукт, що визначає можливість абсорбційного вимірювання.
Оптична щільність вімірюєтьсяна довжині хвилі 700 нм, активність сироваткової аспарагінази визначається задопомогою стандартної кривої.
Переваги методу
• Кожна мікролунка може бутирозкрита і використана окремо.
• Простота методики, що непотребує відмивання або центрифугування.
• Тривалість виконання тесту -близько 2 годин.
• Висока точність результатіваналізу.
Склад набору
Каталог № 550.
1. Пластина з мікролунками: 6рядів по 8 лунок у кожному (у рамці, вакуумгерметично упакована в алюмінієвийконтейнер), легко розкривається, U-подібної форми, спеціально оброблена.
2. Контроль: 2 пробірки - 0,5мл у кожній, аспарагіназа medac Е.Соlі у сироватці людини, ліофілізована.
3. Стандарт: 2 пробірки - 0,5мл у кожній, аспарагіназа medac Е.Соlі у сироватці людини, ліофілізована.
За. Стандарт 1: 600 Од/л Зв.Стандарт 2: 300 Од/л Зс. Стандарт 3: 50 Од/л 3d. Стандарт 4: 0 Од/л
4. Розчинник зразків: 1 флакон- 110 мл, PBS/TWEEN/BSA, pH=7,2-7,4, готовий до використання, містить ProClin™300.
Субстрат: 2 пробірки - 0,75 млу кожній, готовий до використання, містить ProClin™ 300.
5. Хромоген: 2 пробірки - 1 млу кожній, концентрований, Хі, подразливий засіб, R 36/38, S 26, міститьдиметилсульфоксид (EEC № 200-664-3).
6. Розчинник хромогену: 2 пробірки - 2 мл укожній, готовий до використання.
1. Зберігання тастабільність.
| Матеріал/реагент
| Стан
| Зберігання
| Стабільність
|
| Тест-набір
| Закритий
| 2...8°С
| До терміну зберігання
|
| Мікропластина
1
| Відкрита
| 2...8°С
у пакунку з
абсорбентом
вологи
| До терміну зберігання
|
| Контроль
| Відкритий, розчинений
| 2...8°С
| 4 тижні
|
| Калібратор
| Відкритий, розчинений
| 2...8°С
| 4 тижні
|
| Розчинник зразка
| Відкритий
| 2...8°С
| 8 тижнів
|
| Субстрат
| Відкритий
| 2...8°С
| 4 тижні
|
| Хромоген
| Відкритий
| 2...8°С
| 4 тижні
|
| Розчинник хромогену
| Відкритий
| 2...8°С
| 4 тижні
|
Після закінчення термінупридатності використання реагентів не допускається.
2. Реагенти та матеріали,що потребуються, але не входять до складу набору.
2.1. Мікропіпетки відповідногооб''єму.
2.2 Чисті скляні або пластиковіємності для розчинення зразків і хромогену.
2.3.Фотометр для роботи змікролунками та фільтром з довжиною хвилі 700 нм.
3. Підготовка реагентів.
Перед початком дослідження всікомпоненти набору повинні бути кімнатної температури.
Визначте потрібну кількістьмікролунок.
3.1. Мікропластина.
Після вилучення необхідноїкількості мікролунок алюмінієвий контейнер повинен бути щільно упакований.Умови зберігання та стабільність невикористаних мікролунок наведені у табл. 4.
3.2. Калібратори та контроль.
Розведіть кожний ліофілізованийконтроль і калібратори за допомогою 0,5 мл розчинника зразків. Акуратно перевернітьзакриту пробірку для повного розчинення всіх частинок, які пристали на корок.
3.3. Розчинення хромогену.
Змішайте хромоген з йогорозчинником у співвідношенні 1:2.
| Кількість лунок
| Хромоген, мкл
| Розчинник хромогену, мкл
| Сума, мкл
| Необхідний
об''єм піпетки,
мкл
|
| 6
| 240
| 480
| 720
| 600
|
| 7
| 280
| 560
| 840
| 700
|
| 8
| 320
| 640
| 960
| 800
|
| 9
| 360
| 720
| 1080
| 900
|
| 10
| 400
| 800
| 1200
| 1000
|
| 11
| 440
| 880
| 1320
| 1100
|
| 12
| 480
| 960
| 1440
| 1200
|
| 13
| 520
| 1040
| 1560
| 1300
|
| 14
| 560
| 1120
| 1680
| 1400
|
| 15
| 600
| 1200
| 1800
| 1500
|
| 16
| 640
| 1280
| 1920
| 1600
|
Зверніть увагу: при змішуванніз розчинником хромоген розігрівається.
Суміш хромогену з розчинникомне може і не повинна зберігатися. її необхідно використати відразу ж післяприготування.
Не дозволяється змішуватиреагенти із різних наборів та інших виробників.
Отримання достовірних івідтворених результатів можливе лише за умови точного виконання методики тесту тавикористання специфічних реагентів тест-набору.
4. Матеріал длядослідження.
4.1. Тест призначений лише длядослідження зразків сироватки.
4.2. Попередньо не піддавайтесироватку будь-яким впливам для запобігання інактивації. Сироватка не повиннабути контамінована мікроорганізмами, хілезною або вміщувати еритроцити.
4.3. Сироватку слід розчинити за допомогою розчинника зразків у співвідношенні1:10 (тобто 20 мкл сироватки + 180 мкл розчинника зразків). Проби зізначеннями показників поза межами вимірювання піддають більшому розведенню.
5.А. Методика аналізу
5.1. Надріжте алюмінієвий контейнердля мікропластини над "блискавкою" та візьміть потрібну кількістьмікрогумок (див. 3.1).
5.2. За допомогою піпетки вмістіть умікролунки пластини по 20 мкл контролю, калібратора та проби.
5.3. Додайте у кожну мікролунку 20мкл субстрату.
Піпетування калібраторів,контролів, проб і субстрату повинно бути закінчено за 10 хвилин. Акуратнозбовтайте вміст для ретельного перемішування всіх його компонентів. Після цьоговідразу ж почніть інкубацію мікропластини.
5.4. Інкубуйте закриті мікролункипластини протягом 60 хв (±2 хв) при кімнатній температурі (22°С ± 1°С).
5.5. На момент закінчення часуінкубації підготуйте розчин хромогену (див. 3.3).
5.6. В усі мікролунки пластинидодайте 100 мкл розчину хромогену.
5.7. Інкубуйте закриті мікролункипластини протягом 60 хв (±2 хв) при кімнатній температурі (22°С ± 1°С).
Рівномірно перемішайте всікомпоненти шляхом обережного струшування.
Слідкуйте за тим, щоб перед фотометричниманалізом у лунках не було бульбашок повітря.
Фотометричний аналіз слідвиконувати відразу після закінчення останнього етапу інкубації.
5. В. Таблиця проведенняаналізу.
| | Калібратори
| Контроль
| Зразки
|
| Калібратори
| 20 мкл
| -------
| -----
|
| Контроль
| ------
| 20 мкл
| ------
|
| Зразки
| -------
| | 20 мкл
|
| Субстрат
| 20 мкл
| 20 мкл
| 20 мкл
|
| Інкубація 60 хв при кімнатній температурі (22°С ± 1°С).
|
| Розчин хромогену
| 100 мкл
| 100 мкл
| 100 мкл
|
| Інкубація 60 хв при кімнатній температурі (22°С ± 1 °С).
|
| Фотометричний аналіз на довжині хвилі 700 нм
|
6. А. Підрахунокрезультатів (достовірність).
• Прочитайте показники оптичної щільності при довжині хвилі 700 нм. Вимірюванняоптичної щільності blank проводьте проти повітря.
• Обов''язкові показники активності контролю надруковані на етикетці пробірки. Критеріїдостовірності
• Активність контролю повинназнаходитися у межах величин, які вказані ,, (див. етикетку на пробірці).
• Показник оптичної щільностікалібратора 1 повинен бути > 1,500.
• Показник оптичної щільностікалібратора 4 повинен бути < 0,150.
Аналіз слід повторити,якщо результати не відповідають специфічним!
Калібрувальний графік ікількісна оцінка результатів
Показники оптичної щільності(ОЩ) калібраторів наносяться на графік навпроти показників активності.Рекомендуємо для побудови калібрувального графіка використовувати "сubicspline approximation".
Стандартна калібрувальна кривадозволяє визначити показники активності проб аспарагінази відповідно до значеньїх оптичної щільності.
Показники, що вимірюються,знаходяться в інтервалі від 30 до 600 Од/л. Проби з показниками нижче рівня, щовимірюється, повинні бути інтерпретовані як такі, що мають значення активності< 30 Од/л. Проби з показниками вище рівня, що вимірюється, повинні бутиінтерпретовані як такі, що мають значення активності > 600 Од/л. Ціпоказники не повинні бути екстрапольовані, їх визначення слід повторити прибільш високому розведенні.
Якщо проба була виміряна прирозведенні більшому, ніж 1:10, значення активності аспарагінази, яке визначенеза калібрувальною кривою, необхідно помножити на додатковий фактор розведення(наприклад: розведення проби 1:40, визначена концентрація 250 Од/л, реальнаконцентрація становитиме: 250 х 4 = 1000 Од/л).
6.В. Інтерпретаціярезультатів / обмеження щодо використання методу.
• За допомогою medac тестувизначення активності аспарагінази можливе вимірювання активності у сироватцівсіх зареєстрованих комерційних препаратів аспарагінази.
• Калібрування тесту здійснюєтьсяаспарагіназою medac, що дозволяє, застосовуючи тест-кіт, зчитувати точнікількісні значення активності аспарагінази medac, використовуючи стандартнукриву. У пацієнтів, терапія яких проводиться іншими комерційними препаратамиаспарагінази, внаслідок специфічних відмінностей в активності результативимірювань можуть відрізнятися.
• Сучасні наукові дані недозволяють однозначно визначити межові значення активності аспарагінази, якігарантують 100% руйнування аспарагіну, тому кожного разу межові значенняповинні бути визначені відповідно до терапевтичних цілей кожного користувачаабо, відповідно, дослідницької групи. Робота, опублікована Riccardi et al(1981), вказує, однак, на те, що активність аспарагінази > 100 Од/лзабезпечує повне руйнування аспарагіну. -Високі концентрації гемоглобіну табілірубіну не впливають на результати.
7. Характеристикипроведення тесту.
У процесі оцінки діагностичнихможливостей були вивчені такі характеристики проведення тесту.
7.А. Фізіологічнізначення активності аспарагінази.
При оцінці діагностичнихможливостей досліджувались 102 проби сироваток донорів. Виміряти активністьаспарагінази у пробах виявилося неможливим. У всіх пробах активністьаспарагінази була менше 30 Од/л. У доповнення до цього 52 проби сироваток дітейбули досліджені на активність аспарагінази. Показники у цій популяції такожбули менше 30 Од/л.
7.В. Точність.
| Проба
| Варіації всередині аналізу
| Проба
| Варіації між аналізами
|
| | Меап ОD
| SD
| СV
(%)
| п
| | Мean U\L
| SD
| СV
(%)
| п
|
| Std.1
| 2,162
| 0,068
| 3,1
| 22
| К
| 91,5
| 3,7
| 4,1
| 9
|
| К
| 0,530
| 0,006
| 1,2
| 22
| Nr.3
| 38,2
| 1,7
| 4,5
| 9
|
| Nг. 1
| 0,254
| 0,006
| 2,5
| 22
| Nr.4
| 125,5
| 7,5
| 6,0
| 9
|
| Nr.2
| 1,380
| 0,021
| 1,5
| 22
| Nr.5
| 420,3
| 33,7
| 8,0
| 9
|
| | | | | | | | | | | |
Std= калібратор; К= контроль;Nr.= сироватка; OD= оптична щільність.
7.С. Відтворення
Середнє відтворення = 93,6%(SD=9,9%) було вирахувано при додаванні кожної з трьох проб з різною активністюаспарагінази (аспарагіназа medac) до трьох серій наборів реагентів.
7.Р. Лінійність розведення.
Лінійність розведення булаперевірена за допомогою 10 високореактивних сироваток, які були тестовані у 4-5різних розведеннях (кожне наступне у співвідношенні 1:2 до попереднього).
| | Розв. 1 Од/л
| Розв. 2 Од/л
| Розв. 3 Од/л
| Розв. 4 Од/л
| Розв. 5 Од/л
| mean Од/л
| SD
Од\л
| СV,
%
|
| Nr.1
| 1731
| 1789
| 1845
| 1897
| ------
| 1815
| . 71
| 3,9
|
| Nг.2
| 440
| 446
| 465
| 476
| -----
| 457
| 17
| 3,6
|
| Nг.З
| 1569
| 1638
| 1665
| 1672
| ------
| 1636
| 47
| 2,9
|
| N.4
| 359
| 357
| 373
| 375
| ------
| 366
| 9
| 2,5
|
| N.5
| 373
| 380
| 407
| 404
| ------
| 391
| 17
| 4,4
|
| N. 6
| 543
| 520
| 546
| 564
| 614
| 557
| 35
| 6,3
|
| N.7
| 940
| 945
| 972
| 979
| ------
| 959
| 19
| 2,0
|
| N.8
| 8876
| 8889
| 9248
| 8986
| 9125
| 9025
| 160
| 1,8
|
| N.9
| 3609
| 3775
| 4025
| 4273
| -----
| 3920
| 291
| 7,4
|
| N. 10
| 1087
| 1068
| 1116
| 1153
| -----
| 1106
| 37
| 3,4
|
Розв. - розведення.
7.Е. Викривленнярезультатів.
Результати визначенняактивності аспарагінази аж до значень 20000 Од/л не викривлюються.
7. Р. Межі кількісногоаналізу (нижня межа вимірювання, LOG).
Нижня межа вимірювання дорівнює30 Од/л. Загальні рекомендації до проведення аналізу.
• Для запобігання перехресноїконтамінації не плутайте пробірки та кришки, що їм відповідають.
• Відразу після використанняреагенти повинні бути герметично закриті з метою запобігання випаровування тамікробної контамінації.
• Після використання реагентиповинні бути негайно розміщені для зберігання згідно з інструкцією, що гарантуєїх збереження протягом терміну придатності.
• Після використання всікомпоненти тест-набору повинні зберігатися в оригінальній упаковці длязапобігання змішування з реагентами інших тест-систем або наборів (див. 3).
Інформація про правилабезпеки.
• Необхідно дотримуватися правилвиробничої техніки безпеки у межах затверджених національних норм.
• Реагенти, які виготовлені збіологічних рідин людини, тестовані з негативним результатом на наявністьНbsAs, АТ до ВІЛ 1 і 2 типу та НСV. Незважаючи на це, настійно рекомендуєтьсяпри роботі з цими матеріалами, як і з матеріалами тваринного походження (див.вміст набору), вважати їх потенційно контагіозними та використовувати всінеобхідні застережні заходи.
• R 36/38: подразнює очі ташкіру.
S 26: при потраплянні в оковідразу промити його великою кількістю води та звернутися за медичноюдопомогою.
Обговорення проблемивидалення залишків.
Залишки хімічних речовин іпрепаратів є, як правило, небезпечними відходами. Видалення такого родувідходів регулюється національними та регіональними законами. Проконсультуйтесяз місцевими відомствами та компаніями з видалення небезпечних відходів з метоюодержання рекомендацій щодо їх знищення.
Умови та термін зберігання. ЗБЕРІГАТИ В НЕДОСТУПНОМУ ДЛЯ ДІТЕЙ МІСЦІ.Зберігати при температурі 2-8°С у захищеному від світла місці.
Термін зберігання. 1 рік.