ІНСТРУКЦІЯ
для медичногозастосування
діагностичноготеcтового набору ELISA –Фекальна панкреатична еластаза 1
(РancreaticElastase 1 Stool Test)
1. Вступ
1.1 Патобіохімія
Людська панкреатична еластаза 1 (Е1) лишається незмінноюпротягом проходження через кишечник. Тому її вміст у фекаліях відображаєекзокринну функцію підшлункової залози. При розвитку запалення підшлунковоїзалози Е1 потрапляє в кров, тому визначення панкреатичної еластази 1 усироватці може підтвердити або спростувати діагноз гострого панкреатиту.
1.2 Переваги
На відміну від загальноприйнятних лабораторнихпараметрів діагностики захворювань підшлункової залози - активностіхімотрипсину в фекаліях, панкреатична еластаза 1 має такі переваги:
- Е1 абсолютно специфічна для підшлункової залози.
- Оскільки, Е1 стабільна протягом проходження черезкишечник, вміст фекальної еластази 1 відображає секреторні можливостіпідшлункової залози (діагноз або виключення зовнішньосекреторної панкреатичноїнедостатності).
- Визначення Е1 добре корелює із “золотимстандартом” - секретин-панкреозимін та секретин-церулеїн інвазивними тестами.
- Індивідуальні варіації Е1 незначні.
- Замісна терапія не впливає на визначення Е1.Моноклональні антитіла, що використовуються в тесті, не мають перехресноїреакції з еластазами тварин, які містяться у ферментних препаратах.
- Як і інші панкреатичні ензими, Е1 вивільняється вкровообіг при запаленні. Завдяки більшому періоду напіввиведення, ніж у амілазита ліпази, її концентрація залишається високою довше, таким чином діагнозгострого панкреатиту може бути встановлений навіть через 3-4 дні післявиникнення хвороби.
Два тестових набори ELISA (що базуються намоноклональних антитілах) призначені для визначення панкреатичної еластази 1.За допомогою сироваткового тесту визначають Е1 у сироватці крові з метоювстановлення або спростування діагнозу гострого панкреатиту або хронічногопанкреатиту, а також для діагностики панкреатитів, обумовлених ретроградноюпанкреатохолангіографією або жовчо-кам’яною хворобою. За допомогою визначенняфекальної Е1 діагностують або виключають панкреатичну зовнішньосекреторнунедостатність, яка може розвиватися при хронічному панкреатиті, муковісцидозі,пухлинах підшлункової залози або цукровому діабеті.
1.3 Чутливість та специфічність
Діагностична ефективність визначення панкреатичноїеластази 1 у фекаліях була вивчена в різних клінічних дослідженнях. Відповідно,Stein et al. (1993, 1996 & 1997) та Loser et al. (1995 & 1996)порівняли визначення Е1 із інвазивними інтубаційними тестами -секретин-панкреозимін та секретин-церулеїн тестами. Обидва автори встановиличутливість та специфічність понад 90% при встановленні зовнішньосекреторноїнедостатності. На відміну від визначення хімотрипсину, навіть помірнапанкреатична недостатність може бути встановлена шляхом визначення Е1 (Loser etal.).
У дослідженні, яке проводилось Dominguez-Munioz etal. (1995), визначення Е1 порівнювалось з панкреоауриловим тестом. Відповіднодо результатів, специфічність Е1 була більш високою при приблизно рівнійчутливості.
Крім того, дослідження Terbrack et al. (1996),Soldan et al.(1996), Gullo et al. (1997) та Littlewood et al. довели відміннучутливість та специфічність для діагностики муковісцидозу з ураженням підшлунковоїзалози.
1.4 Основний принцип методу
На платівці ELISA розміщують моноклональні антитіла,що відповідають за людську пакреатичну еластазу 1 (Е1). Додають проби тастандартні зразки. Вміст ензиму визначається на підставі інтенсивностіперекисного окислення АБТС ( 2, 2( - азино - біс -(3-етилбензотіазолін-6-сульфонова кислота) діамонієва сіль), колір якоїзмінюється на темно-зелений. Концентрація окисленої АБТС вимірюється шляхомфотометрії.
1.5 Межі вимірювання
Панкреатична еластаза 1 може бути визначена вінтервалі від 0,3 до 10 нг/мл. Це відповідає концентрації ензиму в фекаліях між15 та 500 mгЕ1/г фекалій та дуоденальній концентрації між 6 та 200 mгЕ1/млдуоденального соку. Концентрація, менша за найнижчий стандарт, оцінюється як< 15 mгЕ1/г фекалій або < 6 mгЕ1/мл дуоденального соку.
1.6 Точність
Внутрішньолабораторна варіабельніть була визначенашляхом 20 подвійних досліджень 7 аналізів калу (36-450 mгЕ1/г фекалій).Середній коефіцієнт варіабельності (КВ) становив 5,8% (3,3-7,5%).
Зовнішньолабораторна варіабельність була підрахованапри дослідженні 7 аналізів, які досліджувались протягом 10 різних днів.Середній КВ був 7,7% (4,1-10,2%; Scheefers-Borchel et al., 1992).
1.7 Можливі впливи на результати вимірювань
Нині відомі чинники, які не здатні впливати нарезультати тесту, наприклад, ферментативна замісна терапія не впливає нарезультати визначення еластази 1. У дуже поодиноких пробах фекалій, внаслідокрозведення, результат визначення концентрації Е1 може бути заниженим. Томурекомендується занотовувати консистенцію фекалій. У випадках, коли одержуєтьсяпатологічний результат (<200 mгЕ1/г фекалій), необхідно провести повторнедослідження більш оформленого калу.
2. Реактиви
1. 12 пластинок ELISA, з 8 чарунками, кожна,з моноклональними антитілами до людської панкреатичної Еластази 1 (Е1),
96 чарунків.
2. Концентрований буферний розчин (5х)(чорна кришка) 100 мл,
фосфатний буфер, рН 7,2, з пральним порошком.
3. Екстрагуючий буфер (5х) для проб калу (квадратний
флакон, зелена кришка) 100 мл,
фосфатний буфер, рН 7,2, з пральним порошкомта азидом натрію.
4. Е1 стандарти від 1 до 5, придатні до споживання (синя кришка)
700 mл в кожному,
людська панкреатична еластаза 1 у водномурозчині з азидом натрію.
5. Контроль, придатний для споживання(фіолетова кришка) 700 mл,
людська панкреатична еластаза 1 у водномурозчині з азидом натрію.
6. Другий тип моноклональних антитіл до Е1,кон’югованої з біотином
(антиЕ1-біо) (жовта кришка) 150 mл,
у водному розчині з азидом натрію.
7. ПОД-Стрептавідин, світлочутливий (зеленакришка) 15 мл,
у водному розчині.
8. Розчин субстрату, придатний дляспоживання, світлочутливий (червона
кришка) 15 мл,
АБТС у водному розчині.
9. Стоп розчин, придатний для споживання(біла кришка) 15 мл,
лужний водний розчин.
10. Пластиковий пакет із вологосорбентом дляневикористаних пластинок ELISA.
3. Матеріал для проб та стабільністьпроб
Матеріал проб: невелика кількість фекалій або дуоденальногосоку
Стабільність проб: проби можуть зберігатися три добипри температурі
4-8 0С або до року при температурі- 200С.
Екстракт фекалій можна зберігати притемпературі
4-8 0С протягом одного дня.
4. Зберігання та стабільність тест-набору
Усі компоненти тест-набору стабільні при температурі4-8 0С до кінця терміну придатності, який зазначено на упаковці.Невикористані пластівки ELISA повинні зберігатись у добре заклеєномупластиковому пакеті, що містить вологосорбент.
5. Застереження
Тільки для діагностики in vitro. Буфери дляекстракції, стандарти, контроль та антиЕ1-біо містять від 0,05% до 0,1% NaN3у якості стабілізатора.
Не можна змішувати матеріали різних партій.
6. Процедура тесту
6.1 Підготовка
6.1.1 Підготовка тестового/миючого буфера
100 мл концентрованого буфера 5х (чорна кришка) +400 мл бідистильованої води. Розбавлений тестовий/миючий буфер придатнийпротягом 6 місяців при температурі 4-8 0С.
6.1.2 Підготовка буфера для екстракції
100 мл буфера для екстракції 5х (квадратний флакон,зелена кришка) + 400 мл бідистильованої води. Розбавлений буфер для екстракціїпридатний протягом 6 місяців при температурі 4-8 0С.
6.1.3 Підготовка пластинки ELISA
Залиште пластинку при кімнатній температурі передвідкриттям. Невикористані пластинки ELISA повинні зберігатися у добрезаклеєному пластиковому пакеті, що містить вологосорбент.
6.1.4 Підготовка проб фекалій
Проби можуть бути зважені (переважаючий спосіб);також можуть використовуватись дозуючі прилади.
6.1.4.1 Зважування проб фекалій
Використовуйте для зважування проб цифровілабораторні ваги. Необхідно відщепити невеликий шматочок фекалій (приблизно 100мг).
Додайте до пробного зразка буфера для екстракції,відповідно до маси зразка: 100 мг - 10 мл буфера; 75 мг - 7,5 мл екстракту.Кінцева концентрація повинна бути 10 мг фекалій /мл буфера для екстракції.
6.1.4.2 Дозуючий прилад
Може бути використаний дозуючий прилад компаніїБерінгер Манхайм (Німеччина, кат.№745804), який дозує зразки по 100 мг.Відповідно повинно бути додано 10 мл буфера для екстракції.
Гомогенізація
Суспензія фекалій повинна бути ретельно перемішанапри кімнатній температурі (з використанням міксера). Фекалії мають бутигомогенізовані для повної екстракції панкреатичної еластази 1. Післяекстракції, тривалістю понад 5 хв, суспензія ще раз перемішується. Післяосідання проводять розведення. Зважаючи на те, що панкреатична еластаза 1досить стабільна, екстракцію можна залишати (до 24 год) при температурі 4-80С,та розведення робити наступного дня.
Розведення екстрактів фекалій (1:500)
Підготовка до розведення 1:500:
попереднє розведення (1:20): 50mл витяжки фекалій +1 мл тестового/миючого буфера.
Остаточне розведення (1:500): 40 mл (1:20) + 1млтестового/миючого буфера.
6.1.7. Розведення дуоденального соку(1:20000)
Підготовка до розведення 1: 20000:
попереднє розведення (1:100): 20 mл зразка + 2 млтестового/миючого буфера.
Остаточне розведення (1:20000): 10mл (1:100) + 2 млтестового/миючого буфера.
6.2 Процедура аналізу
6.2.1 Інкубація зразків та стандартів
Tаблиця 1
| | 1
| 2
| 3
| 4
| 5
| 6
| 7
| 8
| 9
| 10
| 11
| 12
|
| А
В
С
D
E
F
G
H
| -
STD1
STD2
STD3
STD4
STD5
PC
S1
| -
STD1
STD2
STD3
STD4
STD5
PC
S1
| S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
| S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
| S10
S11
S12
S13
S14
S15
S16
S17
| S10
S11
S12
S13
S14
S15
S16
S17
| S18
S19
S20
S21
S22
S23
S24
S25
| S18
S19
S20
S21
S22
S23
S24
S25
| S26
S27
S28
S29
S30
S31
S32
S33
| S26
S27
S28
S29
S30
S31
S32
S33
| S34
S35
S36
S37
S38
S39
S40
S41
| S34
S35
S36
S37
S38
S39
S40
S41
|
- дві смужки пластинки ELISA.
- чотири смужки пластинки ELISA.
- повна пластинки ELISA – 12 тестових смужок.
STD – стандарти; PC – позитивний контроль; S1-S4 –зразки.
Порожні – ячейки А1 и А2 містять 50 mл тестового/миючогобуфера кожна.
Стандарти (синя кришка) – придатні для застосування;накапати 50 mл кожного стандарту (нерозчиненого) у смужки 1 та 2 двічівідповідно:
Стандарт 1 = 0,3 нг/мл
Стандарт 2 = 1,0 нг/мл
Стандарт 3 = 2,0 нг/мл
Стандарт 4 = 4,0 нг/мл
Стандарт 5 = 10,0 нг/мл
Контроль, придатний для застосування (фіолетовакришка); накапати 50 mл до ячейок G1 та G2.
Контроль = 4,0 нг/мл ± 10%
Накапати 50 mл витяжки фекалій, розведеної 1:500 (абодуоденального соку 1:20000), дві проби у дві сусідні чарунки.
Інкубувати 30 хвилин при кімнатнійтемпературі
Промивання: випорожнити чарунки та промити кожнутричі тестовим/миючим буфером (8-канальною піпеткою, 250mл/чарунка).Перевернути пластинку та постукати по чистій паперовій серветці до повноговидалення крапель рідини.
6.2.2 Інкубація з другим типом антитіла(анти Е1-біо)
Додайте 50mл/чарунка другий тип моноклональнихантитіл, кон’югованих з біотином – анти Е1-біо (жовта кришка), (розведений1:100 безпосередньо перед використанням).
Для 4 тест-смужок (1/3 пластинки): 20 mл анти Е1-біо+ 2мл тестового/миючого буфера.
Для 6 тест-смужок (1/2 пластинки): 30 mл анти Е1-біо+ 3мл тестового/миючого буфера.
Для 12 тест-смужок (ціла пластинки): 60 mл антиЕ1-біо + 6мл тестового/миючого буфера.
Інкубувати 15 хвилин при кімнатнійтемпературі
Промивання: Випорожнити ячейки та тричі промитикожну 250 mл тестового/миючого буфера.
6.2.3 Інкубація з ПОД – Стрептавідином
Додайте 50 mл/чарунка ПОД – Стрептавідин (зеленакришка), (розведеного 1:400 безпосередньо перед використанням).
Для 4 тест-смужок (1/3 пластинки): 5 mл ПОД -Стрептавідину + 2мл тестового/миючого буфера.
Для 6 тест-смужок (1/2 пластинки): 10 mл ПОД -Стрептавідину + 4мл тестового/миючого буфера.
Для 12 тест-смужок (ціла пластинки): 15 mл ПОД -Стрептавідину + 6мл тестового/миючого буфера.
Інкубувати 15 хвилин при кімнатнійтемпературі в темному місці
Промивання: Випорожнити чарунки та тричі промити кожну250 mл тестового/миючого буфера.
6.2.4 Кольорова реакція
Додайте 100 mл придатного до застосування розчинусубстрату (червона кришка до кожної чарунки).
Інкубувати 5 хвилин при кімнатнійтемпературі в темному місці
6.2.5 Зупинка кольорової реакції
Зупиніть реакцію з субстратом шляхом додавання 100mл стоп – розчину (придатний до застосування, біла кришка) до кожної чарунки.Добре розмішати вміст чарунок шляхом збовтування.
6.2.6 Вимірювання
Визначте оптичну щільність при довжині хвилі 405 нмза допомогою мікротитруючого пластинчастого зчитуючого пристрою в проміжку часу5 – 30 хвилин після внесення стоп-розчину. Добре змішайте вміст передвимірюванням. 492 нм може бути використана як еталонна довжина хвилі.
6.3 Облік результатів
6.3.1 Неавтоматична оцінка
Підрахуйте середню оптичну щільність для кожного зподвійних досліджень.
Побудуйте графік, на якому вісь абсцис – це Е1-концентрація (нг/мл) стандартів, вісь ординат – відповідна оптична щільністьстандартів, яка визначена при дослідженні. У такий спосіб, Ви отримуєтестандартну криву.
Концентрація Е1 в зразках може бути підрахована зістандартної кривої на підставі визначеної оптичної щільності.
6.3.1.1 Проби фекалій
Для визначення концентрації Е1 у фекаліях (mг/1г фекалій)необхідно значення концентрації, визначене за стандартною кривою, помножити на50 (з урахуванням кінцевого розведення).
6.3.1.2 Дуоденальний сік
Для визначення концентрації Е1 у дуодентальному соці(у mг Е1/1мл соку) необхідно значення концентрації, визначене за стандартноюкривою, помножити на 20 (з урахуванням кінцевого розведення).
6.3.2 Облік результатів за допомогоюпрограмного забезпечення ELISA
Розташуйте порожні, стандартні та дослідні комірки увідповідності до порядку, наведеного в таблиці 1. Застосуйте метод лінійноїрегресії. Помножте визначену концентрацію на відповідний коефіцієнт розведенняабо додайте чинник розведення (фекальні проби – чинник 50; дуоденальний сік –20).
6.3.3.Еталонні показники концентраціїпанкреатичної еластази 1
у фекаліях:
норма: 200-500 та більше mг Е1/г фекалій
середня та легка екзокринна
панкреатична недостатність 100-200 mг Е1/г фекалій
тяжка панкреатична недостатність < 100 mг Е1/гфекалій
Вищезазначені концентрації Е1 визначені дляоформлених зразків фекалій. При встановленні концентрацїї < 200 mг Е1/гфекалій, при дослідженні рідких зразків фекалій необхідно повторне дослідженняоформлених зразків (див. розділ 1.7).
В дуоденальному соку:
Кожна клініка повинна визначити свої граничніпоказники.