ІНСТРУКЦІЯ
ПО ФОТОМЕТРИЧНОМУВИЗНАЧЕННЮ АКТИВНОСТІ ГАММА-ГЛУТАМІЛТРАНСПЕПТИДАЗИ (ГГТ)
В СИРОВАТЦІ КРОВІ
ПРИЗНАЧЕННЯ
Набір призначений длякількісного визначення активності гамма-глутаміл-транспептидази в сироватцікрові людини в клініко-діагностичних та біохімічних лабораторіях,науково-дослідницькій роботі.
Набір розраховано на 160напівмікро- (фотометруємий об''єм 3,5 мл) або 80 макровизначень (фотометруємийоб''єм 7 мл) активності ГГТ (з урахуванням холостих та калібрувальних проб).
Діапазон активностей щовизначаються - 0,05-5 мккат/л або 3-300 Е/л.
Коефіцієнт варіації у серії -не більш як 5%.
Набір призначено длязастосування ін вітро.
ПРИНЦИП МЕТОДУ: Під дією гамма-глутамілтранспептидазиглутаміновий залишок з іу-Ь-(+)-глутаміл-4-нітроаніліда переходить надіпептидний акцептор - гліцилгліцин. При цьому звільняється хромоген -п-нітроанілін. Оптичну щільність реакційного розчину вимірюють післягальмування ферментативної реакції оцтовою кислотою.
СКЛАД НАБОРУ
1. Буферний розчин pH (8,0-8,3) - 1 флакон (50±2) мл;
Гліцилгліцин - (0,5 ± 0,05) моль/л
трис-(гідроксиметил)-амінометан- (0,5 ± 0,05) моль/л
2. Оцтовакислота - 2 флакони (50±2) мл;
3. Калібратор: розчинп-нітроаніліну (5,4 ± 0,06) ммоль/л - 1 ампула (5±0,5) мл;
4. Субстрат (у-Ь-(+)-глутаміл-4-нітроанілід(85 ± 5) мг) - 4мікропробірки або 4 таблетки у флаконі.
МАТЕРІАЛ ДЛЯ АНАЛІЗУ
Сироватка. Матеріал стабільнийпротягом тижня при плюс 4 °С або 3 місяці при мінус 20 °С.
ОБЛАДНАННЯ
Фотометричне обладнання, здатневимірювати оптичну щільність при (400-430) нм (для спектрофотометру 405 нм) удіапазоні (0-1,0) од. Кювета з довжиною оптичного шляху 10 мм. Пробірки об''ємом10 мл, колба об''ємом 50 мл, колба мірна об''ємом 1000 мл, мірний циліндр об''ємом50 мл (ГОСТ 1770-74Е). Піпетки об''ємом 0,1 ,5 та 10 мл (ГОСТ 29227-91). Водянийтермостат або баня, здатні термостатирувати пробірки при температурі плюс(37±0,1) °С.
ПРИГОТУВАННЯ РОЗЧИНІВ
Робочий розчин субстрату. Вколбі розчиняють вміст однієї мікропробірки (чи одну таблетку) з субстратом в28 мл дистильованої води (підігріти до температури плюс (50±10) °С). Післяохолодження, до отриманого розчину додають 12 мл буферного розчину із флакона,перемішують та тримають на водяній бані при плюс 37 °С. Розчин стійкий притемпературі плюс 37 °С на протязі 5 годин, при температурі плюс 25 °С напротязі 10 годин або при температурі плюс (4±2) °С протягом тижня (переднаступним вживанням субстрат що випав в осад розчиняють нагріванням на водянійбані).
Розчин оцтової кислоти. Вмістдвох флаконів з оцтовою кислотою переносять в мірну колбу на 1000 мл (принеобхідності флакони підігрівають на водяній бані до повного плавленнякислоти), доливають дистильованою водою до риски та перемішують. Розчин стійкийпри зберіганні у герметичній тарі.
ПРОВЕДЕННЯ АНАЛИЗУ
Аналіз проводиться згідно зтаблицею:
| Відміряти у пробірку, мл
| Дослідна проба
| Проба зрівняння
|
| Напівмікро аналіз
| Макро аналіз
| Напівмікро аналіз
| Макро аналіз
|
| Робочий розчин
| 0,50
| 1,00
| 0,50
| 1,00
|
| Витримують 5 хв. при температурі плюс 37 °С.
|
| Сироватка крові
| 0,05
| 0,10
| -
| -
|
| Витримують точно 15 хв. при температурі плюс 37 °С.
|
| Розчин кислоти Сироватка крові
| 3,00
| 6,00
| 3,00 0,05
| 6,00 0,10
|
| ПеремІШуЮТЬ Та ВИМІРЯЮТЬ ОПТИЧНу ЩІЛЬНІСТЬ ДОСЛІДНОЇ Проби (Едослід.)
проти проби зрівняння. Фотометрирування - див. розділ "Обладнання".
|
КАЛІБРУВАННЯ
Для побудови калібрувальноїкривої готують калібрувальні розчини згідно таблиці:
| Калібрувальни й розчин №
| Калібратор
(мл)
| Дистильована вода (мл)
| Каталітична активність
|
| мккат/л
| Е/л
|
| 1
| од
| ІД
| 0,50
| ЗО
|
| 2
| 0,2
| 1,0
| 1,00
| 60
|
| 3
| 0,4
| 0,8
| 2,00
| 120
|
| 4
| 0,8
| 0,4
| 4,00
| 240
|
| 5
| 1,2
| -
| 6,00
| 360
|
В пробірки відміряють по 0,1 млотриманих розчинів, додають по 7 мл розчину оцтової кислоти, перемішують тавиміряють оптичну щільність проти води при довжині хвилі, при якій виміряласьпроба. Будують калібрувальний графік залежності оптичної щільності відкаталітичної активності.
РОЗРАХУНОК РЕЗУЛЬТАТІВ
Користуючись значенням оптичноїщільності дослідної проби (Едослід.) знаходятьна калібрувальному графіку каталітичну активність ГГТ у дослідній пробі.
РЕФЕРЕНТНІ ВЕЛИЧИНИ
Сироватка мккат/л Е/л
- Чоловіки: 0,25-1,77 15-106
- Жінки: 0,17-1,10 10-66
КОНТРОЛЬ ЯКОСТІ.
Достовірність отриманогорезультату перевіряється тестуванням контрольних сироваток "ЛіонормУ","Ліонорм П" або "Біоконт С".
ПРИМІТКИ
1. Об''єми реагуючих розчинівдозволяється пропорційно змінити, витримуючи співвідношення робочий розчин :сироватка : розчин кислоти = 10 : 1 : 60.
2. Якщо активність ГГТ в матеріалівище 5 мккат/л або 300 Е/л, його розбавляють в співвідношенні 1:4 фізіологічнимрозчином. Отриманий результат множать на 5.
3. При температурі повітря нижченіж плюс 18 °С можливе замерзання оцтової кислоти. Для відтавання кислотинеобхідно підігріти флакон у теплій воді.
УМОВИ ТА ТЕРМІН ЗБЕРІГАННЯ.
Зберігання набору - притемпературі від плюс 2 до плюс 8 °С.
Строк придатності набору - 12місяців від дати випуску (вказана на упаковці)